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本制品采用温和型配方体系，在维持较强抗体洗脱能力的同时，能够降低对NC/PVDF膜结构及膜结合蛋白的扰动，在常温条件下孵育~20分钟通常可以无需封闭即可完成多轮抗体洗脱与再检测。本制品兼容NC膜与PVDF膜，与传统高SDS/β-ME体系再生缓冲液相比，无任何不愉快气味，对NC膜损伤更小，且不易导致PVDF膜透明化。本制品支持多轮抗体洗脱与再检测，推荐常规使用2～4轮检测，对于信号稳定、背景较低的体系，可扩展至5轮以上。建议每轮再生后通过空白ECL或只加二抗检测残留信号，以确认是否适合继续重新检测。在实验示例条件下，NC膜经连续7轮再生后仍可检测目标蛋白。

WB膜再生液也称为WB膜抗体剥离液、WB膜抗体清除液、印迹膜再生液、Western膜抗体洗脱液、Western膜一抗二抗去除液等，可以高效去除印迹膜上的一抗和二抗，而吸附在膜上的抗原基本不受影响，用于Western中转移了蛋白膜的重复利用，可以实现一膜多敷，即一张膜做多次Western印迹实验。

• 理想的WB膜再生液应该是洗脱抗体的同时，不洗脱膜上结合的蛋白或者不改变抗原的结合性质，但是目前没有一种WB膜再生液可以做到只洗脱抗体，而完全不洗脱膜上结合的抗原；也没有一种WB膜再生液可以适用于所有不同亲和度的抗原抗体复合物。WB膜再生液洗脱能力太强，抗原容易被洗脱；太弱，则抗体残留太高。因此，从免疫印迹膜上去除抗体的方案仅能用于定性用途，因为在每个抗体洗脱循环中，或多或少都将洗去少量膜上的蛋白。
  
• PVDF膜比NC膜更坚韧，因此优先推荐使用PVDF膜用于涉及抗体洗脱的实验。
  
• 有文献指出转膜后干燥的PVDF膜或NC膜（未结合抗体），可改善蛋白质与膜的结合，特别推荐用于涉及多次抗体洗脱的实验。然而，在抗体检测之前，必须使用甲醇将干燥的PVDF膜润湿或用1×TBST将干燥的NC膜润湿。已经结合有抗体的膜，不能让膜干燥，否则抗体分子将与膜结合紧密，很难洗脱。因此，在做完一轮ECL发光检测实验后，尽快用WB膜再生液清除掉膜上的抗体，推荐将膜浸泡于1×TBS（非1×TBST）中4℃保存。
  
• 检测时，优先检测低丰度抗原，即先孵育条带较弱（表达较低）的蛋白，再孵育条带明显（表达较高）的蛋白，最后再孵育内参。
  
• 如条件允许，下一轮的抗体杂交实验选择种属来源不同的一抗（对应不同种属的二抗），减少检测的交叉反应。
  
• WB膜再生液仅适用于ECL发光检测的膜上抗体清除，不适合于膜上直接显色（DAB，BCIP/NBT等）后抗体的清除，也不适合荧光检测后抗体的清除。
  
• 为保证再生效率和降低背景，本制品建议一次性使用，不推荐回收后重复使用。

• 在完成ECL化学发光检测后，印迹膜膜在1×TBST中震荡漂洗5分钟，重复漂洗3次，以去除化学发光底物。
  
• 弃溶液，加入适量的WB膜再生液，根据下表操作。
  

  操作温度	震荡清除时间
  25℃摇床慢摇	~20分钟

  膜上蛋白含量高的样品或清除与膜亲和力高的抗体，可以37℃摇床慢摇~20分钟。
  
  
• 弃膜再生液，加入足量1×TBST，在摇床上漂洗3次，每次5分钟，把膜再生液彻底漂洗干净。
  
  • 残余的膜再生液会影响印迹膜后续抗原抗体的的结合，确保要漂洗干净；
    
  • 由于膜再生液中含有洗脱下来的抗体，不建议重复使用WB膜再生液。
• 洗脱效果验证（可选）：
  
  • 直接显影法（空白显影法）-检测HRP残余：漂洗后的已洗脱转印膜先不要孵育新的一抗，直接孵育ECL发光液，曝光5～10分钟，膜上看不到发光条带表明二抗清除得比较干净。如果膜上能看到条带，重复步骤2～3。此方法的局限性是只能验证二抗的洗脱效果，不能检测一抗的洗脱效果。
    
  • 功能验证法（只加二抗法）-检测一抗残余：漂洗后的已洗脱转印膜，常温孵育二抗一小时，1×TBST漂洗三次，ECL发光检测，无原目的蛋白的特异性条带，表明抗体洗脱比较干净；如果原目的条带位置有清晰的信号残余，说明膜上有残余的一抗，重复步骤2～3。
    
  • 回检法-检测再生对抗原影响：建议在多轮洗脱与再检测后，重新检测首轮靶标，以评估膜上抗原保留情况。该步骤可作为WB膜再生液温和性与多轮重复检测兼容性的补充验证。
• 处理完后的印迹膜可以无需封闭，可直接进行下一次Western Blot实验。
  
  • 在多数Western Blot reprobing条件下，本制品洗脱后无需重复封闭即可进行后续抗体孵育。但对于部分高背景抗体或高灵敏化学发光检测体系，重新封闭有助于降低非特异信号。
    
  • 再生后的印迹膜可以置于1×TBS缓冲液（非1×TBST）中，4℃保存。